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实验做不出来或因"干净":实验动物免疫缺陷或成软肋

来源:Nature自然科研

对于大部分实验室来说,实验动物(尤其是啮齿类)都饲养于清洁无菌的环境中。但是一些免疫学家认为,在寻求标准化、无污染的小鼠的过程中,科学家们使这些实验小鼠变得不再是人类免疫系统的可靠模型——适量带点细菌能让小鼠模型更好地用于人类疾病研究。

撰文  Cassandra Willyard

在 2 月一个异常温暖的早晨, Mark Pierson 驱车 20 分钟来到明尼阿波利斯的一家大型宠物店。作为明尼苏达大学的一位免疫学家,Pierson 经常来这里买小鼠,所以大部分员工都认识他。这次他要买十只小鼠,店员把它们从玻璃盒子里捉了出来。Pierson 需要体型较小的小鼠,因为它们通常比较年幼——他的要求算不上严苛。这些小鼠可能都携带了他想要的东西:细菌

这些小鼠即将进入美国监控最严密的实验室之一,该实验室通常用于研究肺结核和基孔肯雅病毒等危险病原体。这些从宠物店购买的小鼠虽然可能不会造成严重的人类感染,但它们携带的病原体会对实验室中数百个其它研究小鼠造成严重威胁。

它们很快就会有新室友,每一个都会与一群黑色的实验室小鼠混养在一起,共享食物、水、小窝,以及最为重要的——病原体。此前,这些实验小鼠一直被饲养在一个极其洁净的环境中,没有接触过大多数的疾病病原,所以其中一些在和宠物店小鼠混养后会生病、死亡。活下来的实验室小鼠将形成更类似于野生小鼠的强大免疫系统,同时可能也更接近人类的真实情况

Pierson 的做法实际上并不符合实验室的规矩。50 多年来,科学家一直在努力使实验室小鼠变得更洁净。在现在的大多数实验室里,动物的笼子、水和食物都要经过消毒处理。明尼苏达大学的免疫学家、Pierson 所在实验室的负责人 David Masopust 指出,他们竭尽全力避免小鼠接触到自然环境中的感染。这些努力卓有成效:随着病原体等复杂因素得到控制,小鼠实验的结果变得越来越稳定。

但是现在有大量的研究表明,这种洁净度是有代价的——啮齿动物无法建立健全的免疫系统。在寻求标准化、无污染的小鼠的过程中,科学家们使这些实验小鼠变得不再是人类免疫系统的可靠模型因为人类生活在充满微生物的世界里,这对于一些在小鼠模型上大获成功的新疗法和疫苗在临床上的应用有重大影响。虽然目前没有明确证据将临床试验的失败归因于实验小鼠过度干净,但 Masopust 认为洁净的人造环境一定有影响。一些基于动物实验的疗法在人体身上的转化成功率不尽如人意,并非什么秘密;根据一项研究的估计,90% 进入临床试验的药物会失败。Masopust 说:“你不得不怀疑,过度洁净的实验环境可能对实验产生了影响,令人被误导。

这就是为什么 Masopust 等人正在开发带菌模型,以便更好地模拟免疫系统在自然界中的建立过程。有些团队会让小鼠感染一些疾病,而另一些则将天然微生物菌群引入小鼠体内。但饲养这些带菌小鼠可能会有风险。密苏里大学的微生物组研究人员 Aaron Ericsson 指出,宠物店里的小鼠携带大量病菌,就跟来自狄更斯所描述的孤儿院似的。实验室动物管理者非常重视生物安全,而小鼠是一种宝贵的资源。研究人员最怕的就是这些小鼠造成大规模感染

散布细菌

Masopust 在十多年前就开始考虑小鼠洁净度带来的问题。实验小鼠的免疫组成与人体的免疫组成之间存在的巨大差异令他感到震惊。当时,许多研究人员认为这是因为遗传学上的差异造成的,但 Masopust 怀疑,部分原因可能在于实验小鼠的生活环境。他想知道这些问题是存在于所有小鼠中,还是仅存在于实验小鼠中。

为了解答这个问题,Masopust 开始比较实验室小鼠、宠物店小鼠以及谷仓里野生小鼠的免疫组成。在实验室小鼠的血液中,抗癌和抗感染的记忆 T 细胞,即接触过病原体的免疫细胞非常少。事实上,实验室小鼠的身体其它组织中几乎完全没有 T 细胞,而这些记忆 T 细胞则广泛存在于人类、野生小鼠和宠物店小鼠的各个组织中。总体而言,实验室小鼠的免疫系统似乎非常“原始”,更接近人类婴儿而非成人的免疫系统。

Masopust 怀疑感染史具有重要作用。因此,他认为可以通过将实验室小鼠暴露于感染因子下来诱导其免疫系统发生变化。如果实验室小鼠的问题在于过于洁净,那么或许可以试着让它们变“脏”。

他设计了一个看似简单的实验:将一只宠物店小鼠放入一个装有几只实验小鼠的笼子里。实验小鼠会感染上宠物店小鼠携带的各种病原体——皮毛螨、蛲虫和小鼠肝炎,或许之后在免疫方面会更接近宠物店的小鼠。与 Masopust 合作的明尼苏达大学免疫学家 Stephen Jameson 指出,这种混养方式“会让传统备受呵护的实验室小鼠更贴近人类可能具有的正常免疫过程”。

然而研究人员遇到的一大难题是不知道该在哪里养这些带菌的小鼠。Masopust 说:“我最不想做的就是污染同事的小鼠。”当他第一次与动物饲养人员讨论这一实验时,大家都很紧张。但幸运的是,明尼苏达大学当时正准备在 Masopust 的实验楼里建造一个高度隔离的实验室——专为生物安全三级(BSL-3)研究而设计,这意味着它能够安全地隔离人类致病菌。同时,它也可以防止带病小鼠将病原体传播给其它小鼠。2013 年,Masopust 等人设法申请到了一个房间。Masopust 说:“我运气好,BSL-3 动物房利用率不高。为了增加收入,实验室允许其他人使用。”现在,这个房间里共有 500 只小鼠,全部养在塑料笼子里,每只笼子里混养着几只洁净的实验室小鼠和一只脏兮兮的宠物店小鼠。

在与宠物店小鼠混养一个月后,“变脏”的实验小鼠开始表现出很多与野生小鼠和宠物店小鼠一样的免疫特征。它们比正常实验小鼠具有更多的分化记忆 T 细胞,并且还发育出了组织驻留记忆 T 细胞。标准实验小鼠的免疫相关基因活性与新生婴儿差不多,而宠物店小鼠和与其混养的实验小鼠的基因活性特征则与成年人更接近。研究人员使用单核细胞增生李斯特氏菌感染这些带菌的实验小鼠,结果发现带菌小鼠比干净的小鼠表现出更强的抵抗性:前者感染三天后携带的细菌数量下降超过四个数量级,这一结果与接种过相应疫苗的实验小鼠相近。

Masopust 在 BSL-3 实验室工作后不久,圣路易斯华盛顿大学的免疫学家 Herbert Virgin 等人独立开展了一个类似的项目,以了解实验室小鼠的免疫系统。但他们并没有使用宠物店小鼠来诱发感染,而是决定自己诱发感染,这种方法比混养更容易控制变量。Tiffany Reese 是 Virgin 实验室的一名成员,也是德克萨斯大学西南医学中心的一名免疫学家,她说:“作为一名训练有素的病毒学家,我想知道小鼠感染了什么病原体。”

他们选择了四种病原体:两种疱疹病毒,一种流感病毒和一种能长期感染小鼠小肠的肠寄生虫。这几种病原体与发展中国家儿童经常感染的病原体相似。研究人员每次用一种病原体感染小鼠,并且让小鼠在下次感染前充分恢复,以便模拟人类感染过程——感染、恢复、再感染。另一组小鼠用盐水进行模拟接种。最后的免疫激发利用了黄热病疫苗,该疫苗是一种减毒活疫苗。

与 Masopust 团队一样,Virgin 团队注意到连续接受感染的小鼠发生了显著的变化,但是两支团队的小鼠在基因表达以及对疫苗的反应方面存在不同:起初,它们的抗体应答是一样的,但一个月后,通过混养感染的实验小鼠的抗体水平较低。目前还不清楚这种差异是否影响疫苗的效果。Virgin 说:“我认为目前尚不能确定这一结果是否有某种现实意义。”尽管如此,他希望带菌小鼠模型能够帮助人们更好地理解免疫系统。

野性的呼唤

其他研究人员则从宠物店以外的方式寻找“脏”小鼠。美国马里兰州糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)的免疫学家 Stephan Rosshart 驱车几百公里去州内和哥伦比亚特区的各个马厩捕捉野生小鼠。

Rosshart 于 2013 年加入了 NIDDK 免疫学家 Barbara Rehermann 的实验室。二人仔细研读微生物组相关文献,发现微生物组对免疫系统有巨大的影响,但大多数论文都是基于两种实验小鼠的对比研究:一些携带来自实验室的微生物组,另一些完全没有微生物组。Rosshart 想知道如果他给实验室小鼠添加野生鼠的微生物组会发生什么,或许那将保留实验室小鼠的遗传背景,但却使其生理更接近野生鼠。

Rosshart 对野生微生物组供体有特殊的要求:成年小鼠、与实验室小鼠基因相似,没有病原体从而不会污染美国国立卫生研究院(NIH)的其它小鼠。Rehermann 试图说服 Stephan 这不是一个好思路,因为操作难度很高。但 Rosshart 仍坚持己见。每天早上,Rosshart 都会开车去 3 到 10 个谷仓,检查 100 多个只捕鼠器,然后将抓到的小鼠带回研究院。随后,他会解剖这些小鼠,并且保存它们的组织和粪便。到了晚上,他沿原路线捕捉更多小鼠,并在捕鼠器中重新放置花生酱。因此,他每天从凌晨 4 点半开始工作,直到午夜才结束。他就这样每周工作 7 天,持续了两个月。Rosshart 说:“如果只做一个星期还是很有趣的,但时间越久,就变得越具有挑战性。”

最终,Rosshart 一共处理了 800 多只小鼠,他和同事们从中选出三只遗传背景适当且没有病原体迹象的小鼠。他们将这几只小鼠粪便中的微生物转移到怀孕的无菌小鼠身上。当后一种小鼠分娩时,它们会将微生物传给幼崽该团队将这些小鼠与从已消毒的实验室环境中获得微生物组的无菌小鼠进行了比较

接着,他们用小鼠适应流感病毒株感染这些小鼠;92% 的携带野生微生物组的小鼠活下来了,而携带标准实验室微生物组的小鼠只有 17% 存活下来了。当研究人员将两组小鼠暴露于可导致结肠癌的化学物质之下时,前一种小鼠的癌症病情也相对轻些。Rehermann 说:“一个大胆的假设是,如果实验室小鼠更像自然环境中的小鼠,那么这些小鼠也会更适用于研究生活在自然环境中的人类。”

然而,更“野生”并不总是会带来更强的抗感染能力。上个月,普林斯顿大学的演化生态学家 Andrea Graham 和她的同事们证实,“野生化”的实验室小鼠更易发生蠕虫感染。Graham 让实验室小鼠在 8 个室外笼子里自由行动。当她释放第一批时,小鼠立即开始探索周围环境,挖洞并寻找新食物,有一些甚至彻夜活动。小鼠碰到的微生物显著影响了它们应对某些寄生虫的能力。Graham 实验室的小鼠能够很快清除寄生虫感染。但“野生化”的小鼠“在几周时间内都感染了大量蠕虫”。研究人员仍在尝试探索可能的原因,这或有助于揭示免疫系统如何在更自然的环境中工作。Rosshart 表示,免疫系统或许优先清除致命的微生物——病毒和细菌,然后再处理蠕虫等非致命的感染。他补充说:“免疫反应不可能完美对抗一切。”

带菌小鼠模型让研究者们很兴奋。纽约 Taconic Biosciences 公司的微生物组产品与服务负责人 Alexander Maue 表示,从多个角度来说,这些研究都具有里程碑意义。这些“脏”小鼠使得研究者“能够探索在正常小鼠模型中无法发现的保护性免疫的不同机制。”

模型的广泛应用

但研究人员还不知道哪些模型最适合用于研究哪些问题。例如,在 Masopust 的研究中,每组实验小鼠获得不同的病原体组合。Masopust 认为这样做有利有弊,因为人类的病原体也是多样化的。而在 Virgin 的设计中,小鼠则获得了明确的一组病原体,但其对免疫系统的影响并没有很明显。

英国爱丁堡大学的免疫学家 Eleanor Riley 指出,这些模型都不能完全复制大自然中的真实情况。野生小鼠在许多方面与实验室小鼠不同:饮食、性行为、日光或温度都会产生影响。她说:“我认为我们需要更多地与生态学家和动物学家合作,共同研究现实环境,如果单纯采取简化的方法会存在一定风险。”

Virgin 表示,即使是在实验室中重现一个简化的野生环境也是令人头痛的问题。他认为大家都意识到这么做的重要性,但问题是这需要很多基础设施。虽然野生微生物组模型解决了许多有关病原体接触的问题,但正如 Rosshart 所知,捕获野生小鼠是极其麻烦的事情。

带菌小鼠模型是否比标准的实验小鼠更能代表人类的状况,进而为药物开发提供更好的测试基础,还有待进一步观察。理想的实验可能需要在新模型中测试一些之前在临床试验中失败的疗法,以查看其结果是否与人类试验结果相同。

Masopust 的团队正在与两家制药公司合作进行这方面的研究。他们选择了一种在人体研究中失败的疗法,其中一家公司想知道带菌小鼠是否可以预测这种失败。另一家公司要求 Masopust 使用他的小鼠来测试在干净的小鼠身上效果显著的候选疗法。初步的数据表明该疗法对带菌小鼠没有明显效果。

其他实验室也开始饲养“脏”小鼠。去年 12 月,西雅图贝纳罗亚研究所(Benaroya Research Institute)的免疫学家 Daniel Campbell 从 NIH 那获得了一笔资助,用于构建带菌小鼠模型。他和同事们想要测试他们为自身免疫病开发的治疗方法。这类疗法似乎对无菌小鼠非常有效,但他表示很多在无菌小鼠上有效的疗法在转化中都失败了。Campbell 认为带菌小鼠比标准实验小鼠的免疫系统更发达,因此可能用做一种更接近真实状况的模型来测试这些疗法。例如,带菌小鼠能够帮助研究者可以更好地检测到副作用,他说:“安全性是一个大问题。”

Campbell 表示构建混养小鼠模型非常具有挑战性,但是它是值得的。他的许多同事都希望用“脏”小鼠去研究一些问题。他说:“我认为很多人都会有兴趣,并且愿意进行相关尝试。”

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