出品：科普中国
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引言：2014年的诺贝尔化学奖颁给了三位科学家：Eric Betzig、Stefan W。 Hell和William E。 Moerner，以表彰他们在超分辨荧光显微镜领域做出的贡献。超分辨荧光显微技术在生命科学领域具有重要意义，但超分辨有什么优点，起到什么作用，怎样实现超分辨？这些问题，让我们来为大家一一解答。
图1 2014年诺贝尔化学奖得主 图片来源：http://www.nobelprize.org/一沙一世界，一花一菩提——生命科学都做些什么
每个生物个体都是一个复杂的系统，以身高170厘米的小明为例，他的手部表面覆盖着皮肤（组织），皮肤由细胞组成，细胞内含有细胞核（细胞器），细胞核的核仁里含有遗传物质DNA（分子），分子是化学过程和生命过程的最小单元。生命科学从微观层面观察生命过程，大到组织和细胞，小到蛋白质、DNA、RNA等化学物质，通过研究它们在生命过程中的变化，揭示生命的物质基础和基本现象。从尺度上来说，组成小明身体的细胞平均尺寸大约几十微米，而最大的分子——蛋白质的尺寸只有几十纳米，相当于他身高的1/107。
孔子告诉我们，工欲善其事，必先利其器。细胞和分子这么小，想要看到它们，需要显微成像技术的帮助。
图2 将人放大数百万倍，“看到”另一个精彩的世界 图片来源：维基百科盲人摸象与隔岸观火——原子力探针显微与光学探针显微
顾名思义，显微成像是一种观察微小物体的手段。原子力探针和光学探针是两种常用的显微技术，前者就像盲人摸象，利用一个微小的探针接近样品，通过反馈的作用力来实现观测，这种触摸的方式只能探测样品表面，还会对脆弱的样品造成损伤，不适用于观察生命过程；相比之下，光学探针显微就像隔岸观火，把探测用的光束打到物体上，通过收集透射或者反射光的方式来进行观测，对样品的影响很小。
图3 两种常见的显微镜 图片来源：维基百科为了提高光学显微的成像效果，以便从复杂的细胞组织中提取出自己想要的细节，科学家还采用了荧光标记的方法，在细胞中加入特殊的荧光标记物，这些标记物在特定的光照下，有的发出红光，有的发出绿光，而且每种荧光标记物都具有一定的选择性，只与细胞中既有的特定分子结合，然后发出荧光。荧光成像大大提高了光学显微成像的对比度，还帮助科学家分辨细胞中的不同结构。图中所示是牛肺动脉内皮细胞，细胞核呈现蓝色，线粒体呈现红色，微丝呈现绿色。然而光学显微也有自己的缺陷——就像用望远镜看天上的星星，即使再先进的、口径再大的望远镜，也没法看清所有星星；显微成像的分辨能力也受到光学成像系统的限制，这种限制来自于光的衍射，因此被称作衍射极限。
图4 牛肺动脉内皮细胞 图片来源：维基百科墓碑上的公式——衍射极限
波动性是光的基本特性之一，由此产生的衍射效应始终困扰着包括显微、望远在内的光学成像系统。德国物理学家Ernst Abbe发现了显微镜的衍射极限，并将公式刻在自己的墓碑上。这里我们不去详细分析衍射极限的成因，只需要大家知道这样一个结论：由于衍射极限的存在，显微成像系统的照明光只能在样品上形成有限小的圆形光斑，被称作艾里斑；同样地，样品上的分子只能在成像相机上形成有限小的圆斑。从成像的角度来说，衍射极限影响下的显微成像系统只能分辨有限小的细节，一般在200纳米到300纳米之间。
前面已经说过，细胞的直径大约几十微米，想要研究细胞内的生命过程，至少要能看清细胞器才行。传统光学显微镜的分辨率用来看细胞还马马虎虎，对细胞器就只能看个大概，没法满足生命科学研究的需求。近年来，科学家们从不同的角度入手，实现突破衍射极限的光学显微成像，也就是文章开头提到的超分辨荧光显微镜。超分辨的实现途径很多，有结构光照明（SIM）、受激发射损耗（STED）、光激活定位显微（PALM）、随机光学重构（STORM）等，限于篇幅我们只讲获得诺贝尔奖的两种——Stefan W。 Hell的受激发射损耗（STED）和Eric Betzig、William E。 Moerner的光激活定位显微技术（PALM）。
图5 衍射极限限制了显微镜的分辨能力 图片来源：维基百科、果壳网管中亦可窥豹——受激发射损耗显微镜
传统光学显微镜采用宽场成像的方式，照明光一次照亮整个成像范围，然后用相机对整个成像范围进行曝光成像，一次获得整幅图像。“管中窥豹”型的扫描成像则有所不同，照明光聚焦在样品上，形成一个极小的光点——也就是所谓的“管”，每次只对光点对应的区域进行成像；当我们改变光点的位置，使它依次扫遍整个样品，也就获得了一幅完整的图像。有人要问了，即使采用“管中窥豹”的方式，每次聚焦的光点依然受到衍射极限限制，系统分辨能力比起所谓的宽场成像没有提高，扫描过程又增加了系统的复杂度，不是自找麻烦吗？Stefan W。 Hell的回答很简单：只要设法缩小“管中窥豹”的“管”，就能提高系统的分辨能力，实现超分辨。
通常的荧光成像是这样的：荧光分子在吸收了照明光（或者叫激发光）A之后，会在很短的时间持续发出荧光B。扫描成像系统的分辨能力取决于A在样品处的聚焦光点大小。Hell找到了荧光的开关——第三种光C，在C的照射下，荧光分子即使吸收了激发光A，也没法再发出荧光B。Hell让开关C同样打在样品上，形成一个四周亮、中心暗的“面包圈”，“面包圈”中心的暗区域比艾里斑还要小；然后把面包圈套在艾里斑上，就像在“管”的出口又加了一个小孔，使“管”的直径大大减少，也就提高了整台显微镜的分辨能力。
图6 “面包圈”限制了激发光A的有效范围
“我只看到星星”，“我看到了银河”——光激活定位显微
荧光分子是荧光样品的最小发光单元，由于衍射极限的限制，在相邻的两个荧光分子同时点亮时，我们只能看到一个光斑，但如果每次只点亮一个分子，就可以通过光斑，计算得到荧光分子的准确位置。
Eric Betzig和William E。 Moerner采用的就是这样一种方法，如果说STED技术核心是“擦除”，那么PALM技术的核心就是“定位”：Moerner发现存在光D可以“打开”荧光。通过控制D的照射剂量，保证每次只有少量荧光分子处在打开状态；当荧光分子在开与关之间切换时，整幅图像中的荧光信号就会像银河中的星星一样亮暗闪烁，只要进行足够多次的开关和成像，就可以组合出整个样品的图像。
图7 溶酶体膜在不同显微镜下的成像结果。（左）传统光学显微镜成像； （中）光激活定位显微镜成像；（右）放大的光激活定位显微镜成像。 图片来源： 果壳网集百家之长，成一家之言——交叉学科的胜利？
作为光学发展史上的重大进步，衍射极限的突破显然是一个物理学问题，三位科学家以化学方法为工具，突破衍射极限并摘走了2014年诺贝尔化学奖，由此受益最大的则是生物学。更有趣的是，三位诺贝尔奖得主都是物理学出身，因此超分辨显微成像技术可以称得上是交叉学科的重大胜利。
随着超分辨技术的发展与成熟，国际上主流研究方向已经由系统本身转向应用，几大显微公司也纷纷推出各自的商业化产品，但空间与时间、成本与性能的博弈还在持续，在可以预见的将来，超分辨显微成像技术仍有进步的余地。
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