来源：知识分子公众号
►如何应对生物武器？U.S。 Navy photo by Photographer‘s Mate 1st Class Shane T。 McCoy。 （RELEASED）， US Navy Newsstand photo， PD
撰文 | 汤波（生物化学与分子生物学博士）
责编 | 陈晓雪
一个异常炎热的夏天，M国突然发生了一场来势汹汹的瘟疫，短短几周时间，竟有数万人感染死亡，所有抗感染药物均告无效。其传染速度之快，死亡率之高，前所未见。好在科研人员很快分离出了这种致病微生物，原来是一种集合多种致命病毒的超级人造病毒，被恐怖分子当成生物武器攻击M国。但是，全世界都没有针对该病毒的特效药物，卫生部门一筹莫展，导致疫情一时难以控制，M国深陷恐慌之中。
这当然是某科幻小说里的情节，但是如果未来真的发生这类以人造病毒为武器的恐怖袭击，一群特殊转基因牛的血液，或许可以用来生产救命良药。
牛血能救命吗？
用动物血清进行免疫治疗已有100多年的历史。19世纪90年代，白喉是威胁欧美儿童健康的主要杀手之一，死亡率在10%以上。德国生理学家埃米尔·冯·贝林（Emil Adolf von Behring）及其同事将患过白喉的老鼠血清注射到新患白喉的老鼠体内后，发现后者竟然痊愈，因此推测感染过白喉的老鼠血清中含有某种对抗白喉杆菌毒素的物质，将其命名为抗毒素。
不久，贝林将白喉杆菌毒素注射到马、牛、羊等大动物体内，从这些动物血液中分离出能抗白喉杆菌毒素的血清，随后将这种抗毒素血清注射到病人体内，取得良好疗效。自此，抗血清疗法成为人类对付传染性病原体的重要武器。贝林也因为发现抗毒素和发明抗血清疗法，于1901年被授予第一届诺贝尔生理学或医学奖。
随着免疫学的发展，科学家发现，这种抗毒素的主要成分其实是动物免疫系统在病原体或毒素入侵机体后，产生的多种不同免疫球蛋白分子，这种混合物能结合同一种抗原，被称为多克隆抗体。以多克隆抗体为主要成分的动物抗血清一度成为治疗肺炎、破伤风和麻疹等多种感染性疾病的重要药物，有些抗血清药物沿用至今，中国最新的药典（2015 版）还将白喉抗毒素、破伤风抗毒素、抗狂犬病毒素、肉毒抗毒素、抗蛇毒血清等抗血清药物列为重要的生物制品。
但是抗血清的多克隆抗体成分复杂多变，批间差异大，质量难以控制，而且抗体分子为动物源蛋白，容易引发病人强烈的过敏反应等副作用，限制了抗血清的大规模应用，逐渐遭到弃用。目前，只有少数病毒和毒素介导的疾病，如狂犬病、蛇毒等，仍沿用抗血清疗法。在很多烈性传染病爆发期间，也有医生采用处于康复期的传染病感染者血清进行抗血清治疗，取得了一定疗效，但因人源抗血清来源有限，且存在传播其它致病微生物的风险，也无法大规模应用。
1975年，英国剑桥大学乔治·柯勒（Georges Jean Franz Köhler）和塞萨尔·米尔斯坦（César Milstein）发明了杂交瘤技术，开启了单克隆抗体时代。相对于多克隆抗体，单克隆抗体是一类结构相同、成分单一的抗体分子，具有高特异性、高功能均一性等优势，很快在癌症、免疫缺陷等疾病治疗领域展现出巨大的应用前景。到2015年底，全球已批准上市的单克隆抗体药物达50多种，总销售额约1000亿美元，占到生物药物市场份额的40%以上。乔治·柯勒和塞萨尔·米尔斯坦也因为发明单克隆抗体生产技术而获得1984年的诺贝尔生理学或医学奖。
由于病毒、细菌等病原体感染机体的机制复杂， 而单克隆抗体只能识别单一抗原表位，在抗感染方面作用有限，目前仅有2种抗感染单克隆抗体药物在美国获得批准，科学家们希望开发出快速生产抗感染特效药物的平台，以应对未知烈性传染病和生物武器的威胁，而利用转基因动物生产人源多克隆抗体则是其中最为激动人心的创新成果之一。
什么牛如此“牛”？
为了解决动物抗血清易引发人体强烈过敏反应这一难题，有科学家提出设想，如果能将人的免疫球蛋白基因转入动物体内，经过免疫后，这些转基因动物或许能生产出人源抗体。
20世纪90年代，国际上多个研究小组相继研制出各种转有人特定抗体重链和轻链基因的转基因动物，以生产人源抗体，但这些转基因动物只能表达单个或少数几种人源抗体分子。2000年，日本麒麟啤酒公司科研人员发明了一种转染色体技术，实现了人源多克隆抗体在小鼠血液中表达。这种转染色体技术，特别之处是将含有人免疫球蛋白的全部重链和轻链基因序列、最大可达2，000，000个碱基对的人染色体片段，与着丝粒、端粒和复制起点等原件组装成新的染色体，再借助微细胞融合技术，将重组染色体完整转入小鼠干细胞，而之前的转基因生物一般只能转入长度约数千或数万个碱基对的基因片段。
转染色体小鼠的血液中虽然能表达人源多克隆抗体，但是小鼠个体小，抗体产量太低。有人提出利用牛等大动物生产人源多克隆抗体，主要因为牛的体型大，血量多，少数几头牛即可生产出大量抗体药物，便于质量控制，足以应对严重的传染病疫情。
2002年，日本麒麟啤酒公司和美国Hematech公司等研究机构合作，将转染色体技术应用到牛身上，培育出一种特殊的转染色体牛，能在其血液中生产人源的多克隆抗体。转染色体牛的技术路线与转染色体小鼠基本相同，主要区别在于转染色体小鼠是先将重组染色体转入小鼠胚胎干细胞，再由小鼠干细胞直接发育成转染色体小鼠，而转染色体牛因为牛的干细胞技术尚未成熟，只能先将重组染色体转入牛的体细胞，借助核移植技术，获得转染色体克隆牛。因此转染色体牛能培育成功，也得感谢体细胞核移植技术的出现。
►转染色体牛制作技术路线图（Kuroiwa Y et al。， 2002）
科研人员在新生克隆牛的血液中检测到了人的免疫球蛋白，表明人免疫球蛋白基因位点在转染色体牛体内能正常进行转录和翻译。由于这些转染色体牛携带所有人免疫球蛋白的重链和轻链基因，理论上，利用任何病原体或毒素对这些牛进行免疫，这些转染色体牛能生产出相应的人源多克隆抗体。不过，第一代转染色体牛还存在一些技术缺陷，其中最主要的是人的免疫球蛋白表达量太低，平均仅为几十微克/升，而人血清中正常人免疫球蛋白浓度可达5-10克/升，因此第一代转染色体技术难以用于商业化生产。
►第一代转染色体牛（Kuroiwa Y et al。， 2002）
根据转染色体小鼠的结果，研究人员推测可能是牛内源免疫球蛋白基因位点的存在，限制了人免疫球蛋白的表达，但是由于当时牛基因组测序工作刚刚启动，牛内源免疫球蛋白基因序列也不清楚，科学家还不能对牛内源免疫球蛋白基因进行基因敲除操作。
直到2009年，在美国农业部和贝勒医学院的领导下，来自25个国家的300多位科学家历经6年时间完成了牛的基因组测序工作——这一成果发表在美国《科学》杂志上。同一年，美国Hematech公司等机构的研究人员在第一代转染色体牛的基础上，成功将牛内源免疫球蛋白重链基因敲除，培育出第二代转染色体牛，结果该转染色体牛的血清中人源多克隆抗体含量显著提高，可达2克/升以上，不过完整的人源多克隆抗体含量只占抗体总量的10-20%。研究人员还利用炭疽毒素保护性抗原对其中一头转染色体牛进行了免疫，然后用炭疽病毒进行攻毒试验，结果表明转染色体牛血清中产生的人源多克隆抗体能完全有效地中和炭疽毒素。
与人血清抗体含量相比，上述改进显然仍没有达到理想状态。2014年，该研究团队再次对第二代转染色体牛进行了改进，将牛内源的免疫球蛋白轻链基因片段也全部删除，获得了第三代转染色体牛——牛内源免疫球蛋白重链和轻链基因位点全部敲除，但含有完整人免疫球蛋白基因位点。这些转染色体牛血清中的全人源多克隆抗体含量平均为5克/升，最高可达15克/升，而且全人源免疫球蛋白分子占抗体总量的50%以上，与人血清抗体相当，标志着生产人源多克隆抗体药物的转染色体牛技术平台已经基本成熟。
对埃博拉病毒小试牛刀
转染色体牛技术平台最初是日本麒麟啤酒公司开发的专利技术，后转让给美国Hematech生物技术公司，最近又归于美国桑福德健康集团。近年来，转染色体牛技术平台受到美国军方的重视，美国陆军传染病医学研究所已投入大量资金，计划与桑福德健康集团旗下的SAB公司合作，共同开发对付埃博拉病毒等致命病原体的人源多克隆抗体药物。
埃博拉病毒是引发人类和灵长类动物发生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，可通过与患者体液、排泄物直接接触，或与患者皮肤、黏膜等接触而传染，死亡率高达30-90%。埃博拉疫情1976年首次爆发，已造成10次有规模的爆发流行，2014年再度在西非爆发，感染病例2.8多万，已造成1.1万余人死亡，是近几十年来全世界最严重的一次疫情。但是，目前对埃博拉病毒病尚无特效治疗方法，最有希望的埃博拉疫苗仍处于临床试验阶段。
2015年9月，美国陆军传染病医学研究所和美国SAB公司联手在《公共科学图书馆·综合》（PLoS ONE）上介绍了抗埃博拉病毒人源多克隆抗体药物的研究成果，研究人员利用可表达埃博拉病毒最致命亚型——扎伊尔型和苏丹型糖蛋白基因的DNA疫苗，对第三代转染色体牛进行4次连续免疫，第2次免疫后即可检测到抗埃博拉病毒人源多克隆抗体的产生，第3次免疫之后，即可观察到高滴度的病毒中和反应；而且一头转染色体牛经过10个星期免疫，所生产的埃博拉病毒多克隆抗体可以满足100-200病人使用，可见转染色体牛的多克隆抗体生产能力非常之大；研究人员还将纯化后的人源多克隆抗体注射到小鼠体内，埃博拉病毒感染试验结果显示，免疫保护率可达80%以上。
2016年4月，英国自然科研旗下出版的开放获取期刊《科学报告》（Science Reports）又公布了一篇关于转染色体牛生产抗埃博拉病毒人源多克隆抗体药物的研究论文，作者同样来自美国陆军传染病医学研究所和美国SAB公司等研究机构。与《公共科学图书馆·综合》论文不同的是，这次研究人员采用扎伊尔型埃博拉病毒的一种重组糖蛋白作为抗原，对第三代转染色体牛进行8次免疫，在第3次免疫之后的5个多月里，两头经免疫的转染色体牛血液中能不断产生大量的高效价人源多克隆抗体，经埃博拉病毒攻毒试验，对试验小鼠的免疫保护率可达90%以上，研究团队接下来计划开展灵长类动物的攻毒试验，并开展相关临床研究，以开发出抗埃博拉病毒的人源多克隆抗体新药。
显而易见，当人类面临未知烈性传染病爆发，或者恐怖分子发动生物武器袭击时，转染色体牛多克隆抗体生产体系具有巨大优势，一头转染色体牛可以在3-5个月时间生产出满足100多人使用的、免疫保护率高达90%以上的人源多克隆抗体药物，平时只要保留200头左右的转染色体牛，即可应对像2014年西非爆发的埃博拉疫情如此严重的传染病危机。目前，转染色体牛生产人源多克隆抗体药物已经在美国申请进入临床试验，美国食品药品监督管理局也出台了关于人血清或动物血清来源的多克隆抗体药物的审批程序，一旦获准商业化应用，对于整个人类来说都是巨大的福音。
