来源：DeepTech深科技
首次为克隆演化做个“快照”
免疫系统中的 T 细胞和 B 细胞，是获得性免疫反应非常重要的组成部分，它们会以特定的克隆形式来识别抗原。
每个 T 细胞和 B 细胞在发育过程中，都有可能通过的可变（variable）、多样（diversity）和连接（joining）区域序列（VDJ 序列）的重排，获得独特的抗原识别受体。
由于抗原识别受体的序列决定了抗原-抗体识别的复杂性和特异性，将拥有同样抗原识别受体序列（尤其是在 VDJ 序列内的 CDR3 片段）的细胞，称为一个克隆群体（克隆）。
随着人体的发育，T 和 B 群体会形成数十亿个克隆。这些克隆广泛分布在人体众多组织内，直接或间接地参与到内稳态维持、炎症反应、肿瘤免疫等方向。
因而，不仅是二者的克隆信息，其空间定位对人们理解免疫疾病和癌症发展，也会起到重要的作用。
那么，如何能够同时获得 T 细胞和 B 细胞的克隆信息和空间信息呢？
在此之前，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）可以测出 TCR 和 BCR 的 VDJ 序列，并了解单细胞水平上的免疫受体多样性。
然而，单细胞测序由于没有空间信息，可能会导致一系列问题，包括细胞互相作用丢失、空间基因表达模式丢失等。
2016 年，佛里森教授及伦德贝里教授共同开发了空间转录组学（Spatial transcriptomics，Spatial GEX）。
这是一种将组织空间信息和基因表达数据结合的技术，通过结合组织切片和转录组测序，能够在组织的空间尺度上对基因表达进行定位。
他们在 Science 发表了首篇通过测序获得空间位置信息的论文，相关技术已于 2018 年被美国生物技术公司 10x Genomics 收购，并将 Visium 空间基因表达解决方案进行商业化[2]。
通过该技术，研究人员能够在组织切片上进行空间转录组学分析，从而更加全面地了解细胞类型和基因表达的空间组织分布。据悉，Nature Methods 期刊还将该方法评为 “2020 年度方法”。
然而，常规空间转录组技术虽然能够有效地保留序列的空间信息，但是由于文库构建上的限制，VDJ 序列无法保留在测序文库中，因而很难获得克隆信息。
在本次研究中，该课题组基于 Visium 空间转录组平台，开发了 Spatial VDJ 技术。他们还开发了长读长（long-read，LR）Spatial VDJ 以及短读长（short-read，SR）Spatial VDJ 两种版本。
前者利用长读长测序（第三代测序）技术，构建具有位置信息的 T 和 B 细胞受体序列的文库。
为了便于该技术向更多的研究者普及，该团队通过改进实验操作，使得一般短读长测序（第二代测序）技术，也能够同时获得空间条码与克隆序列信息。
研究人员在扁桃体组织中，通过分析长读长 Spatial VDJ 的测序结果，鉴定出总计 62533 个独特的 TCR 和 BCR 克隆。
图丨长读 Spatial VDJ 和短读 Spatial VDJ 在人类扁桃体组织中的应用（来源：Science）
Spatial VDJ 最大的优势在于简单易用，具体来说，它可直接从已经获取的 cDNA 文库中杂交捕获，并富集 T 和 B 细胞受体的序列进行测序，而不需要从头重新切片样品，极度简化了操作的过程。
相较于非富集的 Spatial GEX 文库，杂交捕获使 TCR 和 BCR 的序列数量明显增加，并保留了二者序列的位置信息。
图丨Spatial VDJ 可重复地描绘组织切片中的 B 细胞和 T 细胞克隆，并放大经过验证的区域（来源：Science）
Spatial VDJ 技术不仅能够获得克隆信息，还可以用于全面地了解 B 细胞高度动态的成熟过程。
实际上，B 细胞在重新被激活后，会大量扩增并筛选出具有特定克隆的、更高亲和性的 B 细胞。
“在该研究中，我们使用人类扁桃体作为实验载体，获得大量的 T 和 B 细胞受体序列，证明了该方法良好的富集能力与应用潜力。”林麒荣说。
图丨Spatial VDJ 揭示了人类淋巴组织中免疫球蛋白的空间克隆进化（来源：Science）
Spatial VDJ 是首次能够在组织/空间中，展示克隆演化动态过程的技术。
例如，研究人员在两个不同的生发中心，看到了单个克隆家族（clonal family）的演化过程，这是在依托于单细胞测序的研究中很难直观地观察到的。
“得益于更长的测序长度，我们能够对克隆谱系进行更精细的区分，并还原它们的空间分布，就像给克隆演化过程做了个快照。”林麒荣表示。
在基础生物学/医学和临床具有应用潜力
在本次研究中，研究人员验证了 Spatial VDJ 方法的可行性和可重复性，并体现了在基础生物学/医学和临床上的应用潜力。
在生物学基础理论发展方面，Spatial VDJ 提供了更多的研究方向和可能性。例如，探索免疫细胞的发育动态、免疫细胞与非免疫细胞空间相互位置关系，以及它们的潜在互相作用等。
具体而言，Spatial VDJ 可参与到 B 细胞的成熟过程、T 细胞和 B 细胞招募到组织局部的过程、参与到免疫的过程、不同克隆参与的免疫反应是否具有克隆特异性等研究之中。
在临床方面，Spatial VDJ 技术还可以用于评估和优化免疫治疗策略。通过分析免疫细胞在组织中的 VDJ 重排模式和空间分布，结合空间转录组信息评估免疫治疗的靶向性，从而为免疫治疗的个体化和定向治疗提供指导。
与此同时，人们可以在空间中定位 T 细胞和 B 细胞克隆，并进一步确定它们在肿瘤中的位置关系。
也就是说，研究者或临床医生可以直接看到单个与肿瘤相关的免疫细胞克隆，并分析其于肿瘤边缘还是肿瘤内部，以辅助肿瘤免疫疗法方案的制定，或者探究肿瘤免疫逃逸机制和免疫治疗的潜力。
另一方面，人们可以通过抗体的序列找到潜在的抗原，辅助自身免疫疾病的治疗。
此外，Spatial VDJ 还可以用于研究和优化组织工程，以及再生医学领域中的免疫细胞的定位和分布，有助于改进组织工程构建的免疫适应性和功能性。
图丨林麒荣（来源：林麒荣）
据了解，在下一步研究阶段中，研究人员计划基于生物学和临床的价值，继续沿着免疫学方向研究，更深入、更广泛地探索生物学问题。
例如，在肿瘤中确认免疫细胞的具体分布、克隆多样性与肿瘤异质性的相互关系、B 细胞在不同组织和器官内的发育动态等。
该团队希望通过深入探索和研究，能够帮助临床解决当前肿瘤免疫中存在的问题。
与此同时，从生物学的基础研究方面揭示相关机理，探索免疫细胞的发育动态、免疫细胞与非免疫细胞空间相互位置关系，以及它们的潜在互相作用等。
这次研究之所以能够获得突破性进展，除了课题组长期的技术累积，也与组内和组间的开放、包容和友好的科研氛围密不可分。
在现实中，每个人的时间和能力都是有限的，一个人很难“单打独斗”去解决科研中的所有问题。合作团队虽然来自于不同的高校和课题组，但在合作过程中，是一个密不可分的整体。
“每个合作成员都发挥自己的专业知识和特长去积极地解决问题。在此之中，我们不可避免地会有激烈的讨论，但最后我们都能达成科学共识，并进一步开展课题。这也是我在这次研究中最深的心得体会。”林麒荣最后说道。
参考资料：
1.Camilla Engblom,Kim Thrane,Qirong Lin, et al. Spatial transcriptomics of B cell and T cell receptors reveals lymphocyte clonal dynamics. Science 382, 6675(2023)2. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adf8486
2.https://www.scilifelab.se/news/10x-genomics-acquires-spatial-transcriptomics/
3.https://news.ki.se/new-method-is-better-able-to-map-immune-response-and-paves-way-for-new-treatments
排版：刘雅坤
